干貨分享 | 常用PCR技術(shù)及原理

1、PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴(kuò)增增強(qiáng)因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。

5、巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）是指利用兩套PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，第二輪的擴(kuò)增產(chǎn)物才是目的基因片段。如果第一對(duì)引物（外引物）的錯(cuò)配導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物被擴(kuò)增，相同的非特異性區(qū)域被第二對(duì)引物識(shí)別并繼續(xù)擴(kuò)增的可能性非常小，所以通過第二對(duì)引物的擴(kuò)增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的一個(gè)優(yōu)勢在于：有助于從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物。巢式PCR的實(shí)驗(yàn)原理為根據(jù)DNA模板序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，利用第一對(duì)引物（稱為外引物）對(duì)靶DNA進(jìn)行15-30個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增；第一輪擴(kuò)增結(jié)束后將一小部分起始擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100-1000倍加入到第二輪擴(kuò)增體系中作為模板，利用第二對(duì)引物（稱為內(nèi)引物或巢式引物，結(jié)合在第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，進(jìn)行15-30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，第二輪PCR的擴(kuò)增片段短于第一輪。

6、降落PCR

降落PCR（Touchdown PCR）是一種通過調(diào)整PCR循環(huán)參數(shù)，提升PCR反應(yīng)特異性的方法。在降落PCR中，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設(shè)定為，比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度。較高的退火溫度能有效減少非特異性擴(kuò)增，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì)加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低。因此在開始的幾個(gè)循環(huán)中，退火溫度通常設(shè)置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以增加體系中目的基因的含量。當(dāng)退火溫度降低到最佳溫度時(shí)，剩余循環(huán)都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì)出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物。

注：通過以較高的溫度起始，再隨著循環(huán)逐漸降低到最佳退火溫度（黑色曲線），這種PCR方法可提升反應(yīng)特異性（黃色曲線）。目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量（綠色曲線）相應(yīng)的得到富集。

7、直接PCR

直接PCR是指直接從樣品擴(kuò)增目標(biāo)DNA，無需進(jìn)行核酸分離純化。直接PCR分兩類，直接法：取少量樣本直接加入到PCR Master Mix中，進(jìn)行PCR鑒定；裂解法：樣本取樣后，加入裂解液中，裂解釋放基因組，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中，進(jìn)行PCR鑒定。這種方法簡化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了動(dòng)手操作時(shí)間，同時(shí)可避免純化步驟DNA的損失。

推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴(kuò)增。細(xì)胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì)抑制PCR反應(yīng)。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴(kuò)增微量的DNA。

8、重疊延伸PCR

重疊延伸PCR技術(shù) (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使 PCR 產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)目前主要有兩個(gè)應(yīng)用方向：構(gòu)建融合基因；基因定點(diǎn)突變。 

9、反向PCR

反向PCR （Inverse PCR, IPCR）是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的末知序列進(jìn)行擴(kuò)增。反向PCR設(shè)計(jì)之初是為了用于確定鄰近未知區(qū)域的序列，多用于研究基因的啟動(dòng)子序列；致癌性染色體重排，如基因融合、易位和轉(zhuǎn)座；以及病毒基因整合，現(xiàn)在也常用于定點(diǎn)突變，復(fù)制一個(gè)具有預(yù)期突變的質(zhì)粒。反向PCR流程，首先對(duì)模板進(jìn)行限制性酶切消化和連接，選定的限制性內(nèi)切酶不可剪切已知序列，從而使連接發(fā)生于側(cè)翼未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA片段優(yōu)化連接步驟，使其傾向于自我連接而非多片段連接（即形成連環(huán)體）。完成自我連接后，從DNA的已知區(qū)域啟動(dòng)反向PCR。所獲得的擴(kuò)增子每個(gè)末端都含有部分已知DNA序列。隨后，對(duì)這些擴(kuò)增子進(jìn)行測序，檢測上述已知序列的相鄰區(qū)域。

10、數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。除了基因表達(dá)和拷貝數(shù)檢測，數(shù)字PCR也適用于諸如低頻等位基因的辨別、病毒滴定和二代測序文庫的絕對(duì)定量。